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Simoa Homebrew方法开发专题(一)| 利用Simoa平台开发血浆p217+tau的高灵敏度检测方法

专题一:利用Simoa平台开发血浆p217+tau的高灵敏度检测方法


Simoa单分子免疫阵列分析技术是目前市面上最灵敏的蛋白分子检测技术,其可以检测单个蛋白分子,灵敏度达到飞克级别。在肿瘤、神经、感染免疫、心血管、炎症、生殖、眼科等领域都有着广泛应用。Simoa平台是一个开放的研究平台,除现有的商品化试剂盒之外,各领域的研究人员都可自行进行方法开发及分析。

 

来自美国加利福尼亚和比利时比尔塞的科学家通过自行方法开发对p217+tau进行了研究,并将该检测方法应用于阿尔兹海默症(AD)的临床应用评价。

 


Development and validation of a high-sensitivity assay for measuring p217+tau in plasma

Alzheimers Dement (Amst). 2021 May 27;13(1): e12204(IF=14.48)

 

淀粉样蛋白β(A)、微管相关蛋白tau蛋白(T)和神经退行性病变(N)为AD的临床诊断标志。本文利用Simoa平台开发了p217+tau的检测方法,对227名受试者的血浆p217+tau蛋白进行了定量检测,并对其做出临床应用评价。

 

结果显示:p217+tau血浆检测方法准确、精密、稀释线性好、灵敏度高。所有检测的样本浓度均在线性范围内,AD组的浓度高于健康对照组,血浆和脑脊液水平相关。血浆p217+tau结果可预测中枢T和A状态。


两步法与三步法检测的比较 

对96例脑脊液(CSF)标本进行检测,两步法和三步法的检测结果紧密相关(r2  = 0.939)。对10个血清样本进行检测时,在两步分析法中至少有4个样本显示异常高信号,而三步分析法比较稳定。

 


样品稀释液的选择和优化 

使用不同的样品稀释液,用三步法检测四个样品(3个AD患者的血清样品和标准品)的p217+tau浓度。结果可知,含HBR9的Tris稀释液可减少磁珠聚集和假阳性信号。

 


样本适用性  

本研究检测了10名健康对照者和16名轻中度痴呆患者的血清和血浆样本。结果显示,轻度至中度痴呆患者的平均浓度明显高于健康对照组。然而,血浆样本中的p217+tau的浓度约为血清样本的2倍。

 

 

检测稳定性  

本研究开发的检测血浆217+tau的方法,检测动态范围宽,稀释线性好。5次不同检测的标准曲线信号一致。AD患者血清和血浆样品(n=4)以1:2、1:3、1:4、1:5和1:6的稀释度进行检测,回收率稳定在80%-120%之间,变异系数小于20%。

 


检测灵敏度和准确性  

本方法开发检测血浆p217+tau具有良好的灵敏度和准确度。5个质控样本(1个AD患者血浆pool样、1个AD患者血清pool样和3个标准品缓冲液)分别进行检测,实验结果变异系数低(5%–15% CV)。对227名受试者(157名轻度至中度痴呆和70名认知正常)的血浆样本进行了检测,结果显示,平均组内精确度为7.1%CV(98.2%的样本的CV<20%)。

 


临床应用  

对16名淀粉样蛋白阳性痴呆患者的脑脊液和血浆中的p217+tau分别进行检测,显示中度正相关(r2 =0.43)。对227名受试者(69%的轻度至中度痴呆,31%的认知正常)脑脊液和血浆中的p217+tau进行检测,也证实中度正相关(r2 =0.35)。将样本分为淀粉样蛋白(A)阳性(A+,n=160)或阴性(A-,n=50)受试者,显示脑脊液与血浆相关性仅见于淀粉样蛋白阳性受试者(A+受试者与A-受试者的r2  = 0.27与0.01)。 


此外,血浆p217+tau可准确预测中枢淀粉样蛋白阳性和Tau阳性。

 


总结  

血浆p217+tau的检测是一种高度特异、精确、灵敏度高的方法,可以无创地检测中枢淀粉样蛋白和tau状态,有望在不久的将来被纳入AD的临床检测标准中。



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