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学术动态 | 4个案例带你了解国内外科学家利用基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学开发了哪些研究方案

随着蛋白质组学技术应用的快速发展,离子淌度离概念的引入,使得蛋白质组学进入4D新时代,在传统3D保留时间 (retention time)、质荷比 (m/z)、离子强度 (intensity)这三个维度分离基础之上增加了第四维离子淌度 (mobility) 的分离,实现快速采集、更高的灵敏度和特异性,引领临床蛋白质组学在鉴定准度、鉴定深度、定量准确性、检测周期等性能上全面提升,并在基础研究、转化医学、临床蛋白质组学等各个方面展现出了广阔的发展前景和强大的生命力。

 

通过本期推送所带来的研究案例,大家可以了解到国内外科学家如何将基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学应用到实际的研究当中,这项新技术又带来了哪些便利和突破性的研究成果。

 

案例一 

Cross-Linking/Mass Spectrometry Combined with Ion Mobility on a timsTOF Pro Instrument for Structural Proteomics

 

 

交联/质谱 (XL-MS) 和离子淌度的结合在进行蛋白质构象和蛋白质-蛋白质相互作用研究方面仍未得到充分探索。本研究提出了一种在timsTOF Pro质谱仪上分析交联混合物的方法,该方法能够根据离子的气相迁移率分离离子。使用三种基于尿素的MS可裂解交联剂进行交联,这些交联剂在碰撞激活时为交联物质提供不同的碎裂模式。交联物质与非交联肽的区分很容易根据它们的碰撞横截面进行。研究证明了XL-MS/离子迁移率组合方法对三种复杂性增加的蛋白质系统的一般可行性:(i) 牛血清白蛋白 (BSA)、(ii) 大肠杆菌核糖体和 (iii) HEK293T细胞核裂解物。研究确定了总共623个BSA独特的交联位点、670个大肠杆菌核糖体和1623个核裂解物的独特交联位点,对应于1088个蛋白质内相互作用和535个蛋白质间相互作用,并产生564个不同的蛋白质-蛋白质相互作用。该研究结果强调了将XL-MS与离子淌度相结合的优势,不仅可以用于推导单个蛋白质的三维 (3D) 结构,还可以用于进行全系统蛋白质相互作用研究。

 

案例二 

PRM-LIVE with Trapped Ion Mobility Spectrometry and Its Application in Selectivity Profiling of Kinase Inhibitors

 

 

平行反应监测 (PRM) 已成为一种流行的靶向蛋白质定量方法。Bruker timsTOF Pro具有高离子利用效率和一流的采集速度,为PRM分析提供了强大的平台。然而,肽保留时间的零星色谱漂移代表了跨PRM采集的目标可重复多路复用的基本限制。本研究展示了一个可扩展的、基于Python的timsTOF Pro采集引擎--PRM-LIVE,它可以动态调整检测窗口以实现可重复的目标调度。该研究使用iRT肽作为保留时间标准,并在60分钟的PRM-LIVE采集中展示了对来自细胞裂解物的1857种胰蛋白酶肽的可重复检测和定量。作为功能蛋白质组学中的一项应用,该研究在基于活性的蛋白质分析平台中使用PRM-LIVE来评估小分子抑制剂对220种内源性人类激酶的结合选择性。

 

案例三 

High-Throughput Multi-attribute Analysis of Antibody-Drug Conjugates Enabled by Trapped Ion Mobility Spectrometry and Top-Down Mass Spectrometry

 

 

抗体-药物偶联物 (ADC) 是发展最快的一类抗癌疗法。结合单克隆抗体 (mAb) 的高靶向特异性和细胞毒性小分子药物,ADC是复杂的分子实体,本质上是异质的。必须监测一级序列变体、不同的药物抗体比 (DAR) 种类以及药物偶联后起始mAb结构的构象变化,以确保ADC的安全性和有效性。研究开发了一种高通量方法,用于在Bruker timsTOF Pro上使用捕获离子迁移谱 (TIMS) 结合自上而下质谱 (MS) 分析半胱氨酸连接的ADC。该方法可以通过TIMS分析ADC(~150 kDa),然后采用三层自上而下的MS表征策略进行多属性分析。首先,监控ADC的充电状态分布和DAR值 (MS1)。其次,确定通过低能碰撞诱导解离 (CID) 从ADC解离的亚基的完整质量 (MS2)。第三,解离亚基的一级序列的特点是使用升高的碰撞能量 (MS3) 进行CID片段化。研究通过直接注入ADC并使用MS分段在一次3分钟的运行中获取所有三层MS信息来进一步自动化此工作流程。总体而言,该研究突出了一种多属性自上而下的MS表征方法,该方法具有无与伦比的ADC高通量表征速度。

 

案例四 

The Parallel Reaction Monitoring-Parallel Accumulation–Serial Fragmentation (prm-PASEF) Approach for Multiplexed Absolute Quantitation of Proteins in Human Plasma

 

 

 

基于质谱 (MS) 的定量蛋白质组学方法已成为蛋白质生物标志物发现和验证的一些主要工具。Bruker timsTOF Pro质谱仪上开发的平行反应监测-平行累积-连续碎裂 (prm-PASEF) 方法允许将离子淌度作为基于LC-MS的蛋白质组学的一个新维度,并在缩短的分析时间内增加蛋白质组学的覆盖范围。在本研究中,使用prm-PASEF方法对人血浆中的蛋白质进行多重绝对定量,使用同位素标记的肽标准对125种血浆蛋白进行了广泛的 (104-106) 动态范围。LC和MS参数(例如累积时间和碰撞能量)的优化通过将信噪比提高了10倍,提高了一半以上目标(125个肽段中的73个)的灵敏度。总体而言,41种肽的敏感性提高了2倍,25种肽的敏感性提高了5倍,7种肽的敏感性提高了10倍。prm-PASEF方法的实施能够在人血浆样品中进行绝对蛋白质定量(低至1.13 fmol)。在QTRAP仪器上通过MRM测定的血浆蛋白浓度值与在timsTOF Pro上通过prm-PASEF测定的血浆蛋白浓度值的比较揭示了良好的相关性 (R2 = 0.97),斜率接近1 (0.99),证明prm-PASEF非常适合“绝对”定量蛋白质组学。

 

参考文献:

[1]Ihling CH, Piersimoni L, Kipping M, Sinz A. Cross-Linking/Mass Spectrometry Combined with Ion Mobility on a timsTOF Pro Instrument for Structural Proteomics. Anal Chem. 2021;93(33):11442-11450. doi:10.1021/acs.analchem.1c01317

[2]Zhu H, Ficarro SB, Alexander WM, et al. PRM-LIVE with Trapped Ion Mobility Spectrometry and Its Application in Selectivity Profiling of Kinase Inhibitors. Anal Chem. 2021;93(41):13791-13799. doi:10.1021/acs.analchem.1c02349

[3]Larson EJ, Roberts DS, Melby JA, et al. High-Throughput Multi-attribute Analysis of Antibody-Drug Conjugates Enabled by Trapped Ion Mobility Spectrometry and Top-Down Mass Spectrometry. Anal Chem. 2021;93(29):10013-10021. doi:10.1021/acs.analchem.1c00150

[4]Brzhozovskiy A, Kononikhin A, Bugrova AE, et al. The Parallel Reaction Monitoring-Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (prm-PASEF) Approach for Multiplexed Absolute Quantitation of Proteins in Human Plasma. Anal Chem. 2022;94(4):2016-2022. doi:10.1021/acs.analchem.1c03782