数字PCR平台

 

 

数字PCR(Digital PCR, dPCR)

 


       基于泊松分布原理建立的一种核酸分子绝对定量技术。通过微滴发生器形成上万个微滴,其中每个微滴或不含或含有一个至数个核酸靶标分子。每个单分子进行PCR扩增,探针用于检测特定序列的靶标。随后逐个对每个微滴检测有无荧光信号,最终根据阳性微滴的比例,按照泊松分布的原理,通过App计算出待检靶分子的拷贝数。

 

 

仪器

 

       微滴式数字PCR - BIORAD QX200,可对DNA或RNA分子进行绝对定量分析,适用于 EvaGreen 或探针的数字PCR。

 

 

主要用途

 

       ● 基因表达:可对细微变化进行检测,准确性高,重复性佳。

       ● 突变检测:可检测低含量的突变基因,突变序列检测灵敏度高。

       ● 拷贝数变异CNV检测:可通过精确计量目的基因与参考基因,计算比值得到目的基因的拷贝数。

       ● 二代测序数据验证:可直接对二代测序数据结果进行绝对定量分析。

 

 

应用领域

 

       ● 临床应用,肿瘤标志物的检测、肿瘤靶向用药和拷贝数变异分析等

       ● 环境监控,病原微生物的检测、水样本中微生物的检测等

       ● 食品检测,转基因动物的检测、转基因植物的检测

 

 

主要特点

 

       ● 便捷的测定设计,不需要标准曲线

     ● 可通过增加PCR反应的数量提高精确度

     ● 可高度耐受PCR反应抑制剂

     ● 可精确鉴定目标拷贝数,分析微小差异

     ● 简便而易用的工作流程,一次可以检测 96 个样品

     ● 灵活的数字 PCR 化学方法,已针对 TaqMan 水解探针和 EvaGreen 测定进行优化

 

 

 

 

Real time PCR平台

 

 

定量PCR

 


       实时荧光定量聚合酶链式反应,使用荧光杂交探针,利用荧光信号累积监测PCR的扩增效率,用以精确定量起始模板数,通过内外参对特定DNA序列进行定量分析。

 

 

仪器

 

       ABI 7500,通量达 96 个样品。

 

 

主要方法

 

       ● SYBR GREEN法:加入SYBR荧光染料,特异性渗入DNA双链,发射荧光信号,从而监测PCR产物的同步增加。

       ● Taqman探针法:设计特异性探针,扩增时,Taq酶的外切酶活性将探针酶切降解,使淬灭基团与荧光基团分离,从而监测到报告荧光基团的信号,即实现监测PCR产物增加的效果。

 

 

 

主要用途

 

       ● 基因表达(mRNA、miRNA、lncRNA的定量检测)

       ● 基因分型(TaqMan MGB双探针法)

 

 

 

基因编辑平台

 

 

基因编辑

 


       基因编辑是指对基因组中某一特定基因的DNA序列实现敲除、插入或替换的一种技术方法。

 

 

原理

 

       借助特异性DNA双链断裂(Double-strand Breaks, DSBs)激活细胞天然的修复机制,包括非同源末端连接(Non-homologous End Joining, NHEJ)和同源重组修复(Homologous Recombination, HR)两条机制。

       NHEJ修复机制:断裂的DNA修复重连的过程会发生碱基随机的插入或丢失,造成移码突变使基因失活,实现目的基因敲除。如果一个外源性供体基因序列存在,NHEJ机制会将其连入双链断裂DSB位点,从而实现定点的基因敲入。

       HR修复机制:在一个带有同源臂的重组供体存在的情况下,供体中的外源目的基因会通过同源重组过程完整地整合到靶位点,不会出现随机的碱基插入或丢失。如果在一个基因两侧同时产生DSB,在一个同源供体存在的情况下,可以进行原基因的替换。

 

 

基本技术

 

       CRISPR-Cas9技术是目前在科研、医疗领域中最有效、最便捷的基因编辑工具。

 

 

主要用途

 

       ● 基因敲除:基因上产生DSB,在非同源末端连接修复过程中会产生DNA的插入或删除,从而造成移码突变。

       ● 突变引入:用含有特异突变的同源模板,位点产生DSB提高重组效率,从而实现特异突变的引入。

       ● 定点转基因:同源模板中加入转基因,在DSB修复过程中拷贝至基因组中,从而实现定点转基因。

 

 

主要特点

 

       ● sgRNA构建容易,操作简单,靶向精确性高

       ● 基因修饰率高,基因调控方式多样,例如敲除、插入、抑制、激活等

       ● 可对基因组精确定位和改造

       ● 可实现对靶基因多个位点同时敲除

       ● 无物种限制

       ● 成本低,效率高,实验周期短

 

 

基因编辑技术的主要用途:

 

       ● 基因功能研究

       ● 基因治疗

       ● 构建模式动物

       ● 改造和培育新品种